位点特异性重组法

这类方法使用来源于噬菌体的重组酶，这类重组酶能够识别特异性序列位点(长度数十碱基对至数百碱基对)并引发含有该位点的序列之间的重组；在腺病毒骨架和穿梭质粒中添加重组酶能够识别的特异性位点，在细胞内表达对应的噬菌体重组酶或体外使用重组酶，介导骨架质粒和穿梭质粒之间的位点特异性重组，将目的基因引入骨架质粒，形成带有重组腺病毒基因组的腺病毒质粒；转染包装细胞，进行病毒载体拯救。该方法进一步简化了腺病毒质粒的制备过程，它的缺限是在腺病毒基因组的某些部位不可避免的残留了重组酶特异性识别位点。

典型的腺病毒载体系统如：穿梭质粒pCA13/腺病毒基因组质粒pBHG11/包装细胞293细胞。pCA13/的HCMV IE启动子－多克1隆位点－SV40 AN（poly A）构成外源基因的表达盒，该表达盒的插入使腺病毒E1基因缺失，但是保留其两端侧翼序列（左侧的1~3bp的ITR，右侧从3.5kb到末端的维持病毒装配和活力必须的蛋白IX的基因），也保留了腺病毒的包装信号

φ（194~358bp）；pBHG11则保留了腺病毒基因组的绝大部分，腺病毒载体，但是缺失了包装信号φ、0.5~3.7图距（mu）部分的E1区、77.5～86.2mu的E3区，293细胞是整合有Ad5 E1基因的人胚shen细胞系。pBHG11因为缺失包装信号及E1区而不能copy，pCA13带有包装信号及E1的侧翼序列，但是缺失E1区及腺病毒绝大部分基因组，同样不能copy。外源目的基因插入pCA13后，与pBHG11共转染，进入293细胞。pCA13与pBHG11在细胞内发生同源重组，同时，293细胞提供E1蛋白，从而包装产生腺病毒颗粒。该病毒的蛋白质外壳同野1生型腺病毒相似，具有同样的感1染力进入靶1细胞的能力，但是基因组DNA的E1区被外源目的基因取代，即进入靶1细胞后病毒不能copy，但可以表达目的蛋白。

PEG法

　　其基本原理是在二价阳离子（Mg2 、Ca2 等）存在的情况下，PEG能够有效地诱导DNA产生颗粒状沉淀，从而使细胞膜能够通过内吞噬作用吸收这种DNA颗粒。

　　1993年Golovkin等用PEG法将H89的原生质体与含有鼠二氢叶酸还原酶（DHFR）突变基因（氨甲1喋呤抗性）的质粒共培养，此基因插入了玉米Ds1转座子中。筛选得到的愈伤组织，在不含激1素的培养基上再生长出植株。同年Omirulleh等用PEG法将外源基因导入到了HE89的原生质体中，建立了植株再生的转化体系。

　　PEG法虽然转化效率较高，但必须以裸1露的原生质体为受体，而且还受到基因型的限制。

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