位点特异性重组法

这类方法使用来源于噬菌体的重组酶，这类重组酶能够识别特异性序列位点(长度数十碱基对至数百碱基对)并引发含有该位点的序列之间的重组；在腺病毒骨架和穿梭质粒中添加重组酶能够识别的特异性位点，在细胞内表达对应的噬菌体重组酶或体外使用重组酶，介导骨架质粒和穿梭质粒之间的位点特异性重组，将目的基因引入骨架质粒，形成带有重组腺病毒基因组的腺病毒质粒；转染包装细胞，进行病毒载体拯救。该方法进一步简化了腺病毒质粒的制备过程，它的缺限是在腺病毒基因组的某些部位不可避免的残留了重组酶特异性识别位点。

真核细胞同源重组法

1994 年，Graham F建立了在293细胞同源重组产生重组腺病毒的方法。这个方法需要2个质粒：骨架质粒含有腺病毒绝大部分基因组序列，但不含有包装信号；穿梭质粒含有ITR、包装信号和目的基因克1隆位点，以及两段与骨架质粒有重叠的序列。将目的基因克1隆到穿梭质粒，与骨架质粒共转染293细胞，由于这两个质粒的部分序列有重叠，能够在细胞内发生同源重组，zui终产生完整的载体基因组，并包装出重组病毒颗粒。该方法曾经被广泛使用，推动了腺病毒载体的发展。由于细胞内重组效率低，某些重组事件还可能产生可copy病毒(RCV)，必需经过噬斑纯化才能获得正确的克1隆化的重组病毒，费时费力，正逐渐被其他方法替代。

基因枪法的优点是无宿主限制，受体类型广泛，操作迅速、简单，能有效地转化质体。由于取材广泛，金属微粒的喷射面广，转化频率高，腺病毒载体，所以具有广泛的应用前景。缺点是转化的DNA部分片段太大时DNA部分片段容易断裂，基因枪转化过程中，同源序列可通过DNA-DNA、DNA-RNA、RNA-RNA的相互作用，导致转录或转录后水平的基因沉默。另外，外源DNA往往成簇地整合到受体基因组中，而且可能以多种方式发生重排，所以转化体中的外源基因常常是多拷贝的。但对于这些不足，目前已有研究者在研究其机理并寻求解决办法。


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