PCR的创建

Khorana (1971)等zui早提出核酸体外扩增的设想：“经DNA变性，与合适的引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可合成tRNA基因。”但由于当时基因序列分析方法尚未成熟，热稳定DNA聚合酶尚未报道以及引物合成的困难，这种想法似乎没有实际意义。加上分子克1隆技术的出现提供了一种克1隆和扩增基因的途径，所以Khorana的设想被人们遗忘了。

1983年4月的一个星期五晚上，他开车去乡下别墅的路上，猛然闪现出“多聚酶链式反应”的想法。

1983年12月，Mullis用同位素标记法看到了10个循环后的49 bp长度的第yi个PCR片段；

1985年，Kary Mullis在Cetus公司工作期间，发明了PCR。Mullis要合成DNA引物来进行测序工作，却常为没有足够多的模板DNA而烦恼。

1985年10月25日申请了PCR的专1利，

1987年7月28日批准（专1利号4，683，202 ），Mullis是第yi个发明人；

1985年12月20日在Science杂志上发表了第yi篇PCR的学术论1文，Mullis是共同作者；

1986年5月，Mullis在冷泉港实验室做专题报告，全世界从此开始学习PCR的方法。

PCR法不仅仅局限于分子生物学，还因其简便、迅速等特点被广泛应用于医学、法医学、食品、环境卫生检验、动植物检验等其它领域。Taq DNA聚合酶是PCR法普遍使用的聚合酶，但其具有如下局限性。

1. 可信度 (Fidelity)：通常Taq DNA Polymerase的Fidelity并不高，PCR反应有时会出现错配 (Misincorporation) 现象，因而PCR克1隆、变异导入等实验中，需加以注意。

2. 扩增的DNA长度：使用Taq DNA Polymerase进行PCR扩增时，通常可扩增几kb的DNA，超过10 kb则比较困难。这就给利用PCR进行Mapping等Genome解析带来麻烦。

3. 扩增量：使用Taq DNA Polymerase进行PCR产物克1隆及食品、环境卫生检验等时，Powerful PCR，扩增量常常达不到要求。为解决以上难题，Takara在对Polymerase、Buffer及反应条件等进行深入研究的基础上，开发了LA PCR (Long and Accurate PCR) 技术，运用此技术可大量正确地扩增长达40 kb 的DNA部分片段。LA PCR技术扩展了PCR的应用范围，可在Genome解析、基因诊断、长片段 DNA的克1隆及变异导入等方面发挥优势。

PCR循环参数

预变性模板DNA完全变性与PCR酶的完全激1活对PCR能否成功至关重要，建议加热时间参考试剂说明书，一般未修饰的Taq酶激1活时间为两分钟。 

变性步骤：循环中一般95℃，30秒足以使各种靶DNA序列完全变性，可能的情况下可缩短该步骤时间。变性时间过长损害酶活性，过短靶序列变性不彻底，易造成扩增失败。 

引物退火：退火温度需要从多方面去决定，一般根据引物的Tm值为参考，根据扩增的长度适当下调作为退火温度。然后在此次实验基础上做出预估。退火温度对PCR的特异性有较大影响。

引物延伸：引物延伸一般在72℃进行（Taq酶zui适温度）。但在扩增长度较短且退火温度较高时，本步骤可省略延伸时间随扩增片段长短而定，一般推荐在1000bp以上，含Pfu及其衍生物的衍生设定为1min/kbp。

循环数：大多数PCR含25-35循环，过多易产生非特异扩增。

zui后延伸在zui后一个循环后，反应在72℃维持10-30分钟．使引物延伸完全，并使单链产物退火成双链。

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